单细胞中内容物体积少、含量低、种类多、分析窗口有限，使得高灵敏、高信息覆盖度、快速、高通量的单细胞分析面临重大挑战。通过单次测量实现多维度、多参数的单细胞定量信息获取，对于细胞分型、鉴定以及单细胞水平的疾病相关分子机制研究具有重要意义。单细胞测序技术方兴未艾，但针对单细胞中蛋白质和代谢物的分析技术仍非常有限，尤其是大量蛋白质和代谢物的同时分析尚未见报道。荧光流式细胞术可对单细胞中多种蛋白质进行分析，然而光谱带宽重叠问题限制了其同时测定的通道数。以CyTOF为代表的质谱流式细胞仪可实现单细胞中40余种蛋白质的同时定量分析，但其依赖于ICP-MS仪器，且ICP-MS无法提供细胞内源物质结构信息，极大地限制了方法的检测对象；有机质谱的结构鉴定能力强、质量分辨率高，可实现单细胞中小分子代谢物的分析。基于有机质谱建立流式细胞分析新方法，从而获取单细胞中蛋白组、代谢组等多组学信息，在单细胞异质性相关研究具有不可替代的分析优势。
分析与环境分子科学研究部刘虎威/白玉课题组于2019年报道的工作利用新型兼具质谱增敏和信号放大策略的质谱探针，构建了常压质谱免疫分析平台，实现了zmol的蛋白质检出限以及最低13个细胞表面3种蛋白质的定量分析（J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 72-75）。最近，研究团队对质谱探针进行拓展，并利用基于狄恩流的微流控芯片实现单细胞排列，结合纳升电喷雾-高分辨质谱（nanoESI-HRMS），搭建了多维度有机质谱流式细胞分析平台（图1）。该平台能够高通量地对单细胞水平的蛋白质和代谢物等多维度的信息进行同时获取。相关成果2020年10月21日以“Multi-Dimensional Organic Mass Cytometry: Simultaneous Analysis of Proteins and Metabolites on Single Cells”为题在Angewandte Chemie International Edition杂志在线发表（doi.org/10.1002/anie.202009682）。
图1 多维度有机质谱流式分析平台
该工作中设计并合成了一系列基于罗丹明质量标签的质谱探针，对单细胞表面的CA125，CEA，EpCAM，CD24，CD44和CD133等重要的蛋白标志物进行标记；标记的细胞利用基于迪恩流的微芯片实现单细胞排列，并利用nanoESI-HRMS实现单细胞检测。离子化过程中可实现质量标签的高效解离和细胞内容物的有效释放，从而确保了单细胞中蛋白质和代谢物信息的同时获取。该质谱流式分析平台成功实现了单细胞水平6种目标蛋白质及84种代谢物的同时检测，证实了蛋白质和代谢物在细胞个体间的显著差异性（图2）。
图2 A2780细胞质谱流式分析结果
基于该多维度有机质谱流式细胞分析平台所获取的信息，工作首次同时利用蛋白质及代谢物信息作为细胞分型依据，在5种肿瘤细胞的PCA分析中获得了更好的鉴定和分型结果。在利用Ward’s法得到的聚类结果中，相比于利用单一的蛋白质或代谢物信息，使用蛋白质和代谢物的综合信息能够获得更高的分型灵敏度和特异性。单细胞分析方法在干细胞研究、细胞耐药性研究以及癌症治疗等方面具有重要意义，该流式平台还成功实现了肿瘤细胞耐药异质性分析，其结果有望为分子水平的耐药性细胞研究或癌症干细胞研究提供分析依据（图3）。
图3 细胞分型和肿瘤耐药差异性结果图
近几年来，刘虎威/白玉课题组致力发展基于质谱的复杂生物体系中痕量生物标志物分子的高效、高灵敏和高通量测量新方法和新应用。上述内容已经申请国际专利PCT（PCT/CN2020/083482）。
